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用-150~-196℃的液氮超低温保藏菌种，是现在菌种保藏中使用的一项先进技术。目前， 美国标准菌种保藏委员会(American Type Cultur Collection，ATCC) 保存的17万余株微生物菌种， 全部采用冷冻干燥和液氮超低温法保藏。超低温能使菌种的代谢水平降到最低，菌种基本上不发生变异。试验证明，用这种方法能保存所有的食用菌菌种，包括一些不能用冷冻干燥法保藏的菌种。美国标准菌种保藏委员会曾用液氮法保藏了粗柄羊肚菌、大秃马勃、墨汁鬼伞等培养 真菌，连续观察了9年，发现这些菌种仍能保持良好的活力。也有人将蘑菇菌种在-160~-196℃下保藏22~26个月后，发现这些菌种仍完好无损。最有趣的V定 是怕冷的草菇在10%甘油保护下，居然也能在超低温冰箱中保藏。 虽然液氮保藏法有保藏的菌种不宜邮寄交流，还需要特殊的设备———液氮罐等缺点，但其保藏效果好、范围广、操作简单，因此得到普遍应用，其方法如下： (1)将保藏用的琼脂培养基(马铃薯煮汁1000mL、葡萄糖20g、酵母膏1.5g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.5g、琼脂20g)倒人无菌培养皿内制成平或少 板，然后在平板中心接种食用菌菌丝，在适温下培养至菌丝发满平板。 (2) 保藏安部瓶的口径约10mm， 大小为7.5mmx10mm， 内盛经灭菌的冰满 冻保护剂0.8mL。冰冻保护剂常用10%甘油或10%二甲亚砜(DMSO) ， 需经高压灭菌后使用。 (3)取直径5mm的打孔器在菌落的外围切割琼脂块，用无菌镊子将这种带有菌丝体的琼脂块移入灭菌的保藏安瓿瓶内的保护剂中。注意在保藏菌种管上作永久标记。也可直接用无菌保护剂制备菌悬液。 (4)用火熔封安部瓶的瓶口。 (5)将封好口的安部瓶放在慢速冷冻器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降藏 温，直至-35℃左右，使瓶内的保护剂和菌丝块冻结。然后冻结速度不再控制，至到-150℃以下。将冻结的安部瓶立即置于液氮罐中保藏。液氮罐内气相温度为-150℃，液相温度为-196℃。 (6)复苏培养。启用液氮超低温保存的菌种时，应先将安瓿瓶置于35~40℃的温水中来回振荡，使瓶内的冰块迅速融化，然后在无菌条件下开启安瓿瓶，取悬浮的菌丝块移植于适宜的培养基上活化培养。 使用液氮超低温法保藏菌种时，操作者要戴皮手套或棉手套，严防液氮飞溅伤人；取菌种时，要垂直轻取盖塞，再垂直提起提筒，轻轻移到容器中取物。取毕立即将提筒与盖塞复位，以防空气中氮气过浓引起窒息。 |
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